Фемтосекундный лазер с возможностью изменения длины волны для биомедицинских исследований

Войцехович В.С., Зайцев С.Л., Каневский В.А., Матяш В.И., Фильчаков И.В.

Использование лазеров в медицине имеет более чем 30-летнюю историю. Прежде всего, стратегия выбора лазеров базировалась исключительно на их доступности, с последовательным экспериментальным подтверждением их эффективности для решения конкретной задачи.
В ведущих Институтах НАН Украины были проведены теоретические и экспериментальные исследования, которые свидетельствовали о принципиальной возможности управления разными биологическими процессами при помощи квантов света [1, 2, 3]. Для этого использовался свет различной длины волны, что позволило установить специфичность действия облучения в узких диапазонах спектра на разные биологические объекты, которое зависело, в первую очередь, от спектрального диапазона. В практическом плане проведение исследований по изучению спектра действия монохроматического излучения на биологические объекты с помощью обычных лазеров, которые генерируют свет в одном, или в нескольких строго фиксированных диапазонах, практически невозможно. Нужно было иметь возможность плавно изменять длину волны излучения лазера, подстраиваться под разные биологические процессы, которыми мы хотим управлять. Именно таким требованиям отвечает фемтосекундный лазер с возможностью перестройки длины волны, который использовался нами для целенаправленного влияния на разные биологические процессы. Первые фундаментальные научные исследования проводились на молекулярном и клеточном уровнях [4, 1]. Доклинические исследования были проведены в Институте токсикологии и фармакологии АМН Украины соответственно требованиям ДСТУ ISO 10993-1: 2004 «Биологическое оценивание медицинских изделий».

Первые научные исследования показали, что одним из возможных молекулярных механизмов влияния света на биологические объекты есть взаимодействие света с активными центрами важнейших металло-ферментов, которые стоят на перекрестке узловых участков клеточного метаболизма, или в начале биохимических процессов каскадного типа. Поглощение фотонов лазерного излучения в определенном спектральном диапазоне соединениями металл-лиганд активных центров металло-ферментов приводит к конформационной перестройке структуры металло-ферментов, которая запускает или выключает определенные биохимические процессы. В качестве примера можно привести ферменты, в активном центре которых находятся такие металлы как Fe , Mg, Zn, Са . Так, ферменты с магнием в активном центре контролируют почти все процессы с генетическим материалом ДНК-полимеразы, транскриптазы и др., с железом в активном центре - энергетические процессы, связанные с синтезом АТФ (цитохром-оксидазы и др.). Метало ферменты с Zn и Са, как правило, играют роль молекулярных триггеров, которые регулируют определенные каскадные процессы. Много металло-ферментов и соединений металлов с биологическими молекулами играют важную роль в развитии иммунного ответа (Са-неврин, Zn-тимулин и др.). Также известно неспецифичное действие лазерного света на биополимеры (белки, липиды, мембраны клеток), вследствие чего изменяются их конформационное строение и функциональное состояние.

Что касается использования лазерного комплекса для лечения больных, то, прежде всего, необходимо указать, что наиболее значительные терапевтические эффекты, установленные в настоящее время, связаны с противовоспалительным, иммуномоделирующим, регенераторным, противоопухолевым действием лазеротерапии. Такие эффекты обусловлены не только местным действием лазерного излучения, но и системными реакциями с включением многих функциональных систем организма. Развитие системных нейрогуморальных реакций связано с действием на проекцию вегетативных центров симпатичной иннервации и продукцией биологически активных молекул в тканях и появлением эффективных концентраций этих молекул в циркуляции. Эффекты действия лазеротерапии обуславливают повышение резистентности организма и активацию механизмов саногенеза, что существенно повышает эффективность терапии хронических заболеваний.
Для проведения процедуры лазеротерапии нами использовался фемтосекундный лазер с возможностью перестройки длины волны излучения - «Комплекс лазерный медико-биологический» (ТУ У 33,1-34413533-001.2008, свидетельство о государственной регистрации № 8445/2008, от 24.12.2008). Спектральный диапазон действия: 350-450 нм; 510 – 660 нм. Плотность мощности излучения 5-20 мВт/см2 .
Клинические исследования проводились на базе ГУ «Институт эпидемиологии и инфекционных заболеваний им. Л. В. Громашевского АМН Украины», г. Киев, ул. Амосова, 5. Исследования проводились на больных хроническими вирусными инфекциями (гепатит В, С, герпесвирусные инфекции, СПИД) – 120 человек.

В качестве объектов, которые облучались светом лазера в разных спектральных диапазонах, нами были выбраны зоны проекции тимуса, крупных сосудов, n.vagus. В случае облучения зоны проекции тимуса под влияние лазерного света попадали непосредственно ткань тимуса, кровеносные и лимфоидные сосуды, периферийные нервы симпатической и парасимпатической систем. Все пересчитанные зоны имеют свои механизмы и временной масштаб ответа на действие лазерного света, который обуславливает разнообразие клинических проявлений. Так, облучение нервов симпатической и парасимпатической систем приводит к выбросу катехоламинов в периферическую кровь, которая приводит к запуску определенных нейрорегуляторных процессов. Влияние лазерного света непосредственно на ткани тимуса приводит к существенному изменению в количественных показателях и функционального состояния эффекторов иммунной системы, которое находило свое отображение в иммунограммах пациентов.

Исследование влияния лазерного облучения на онкозаболевания (рак легких, пищевода, полости рта) проводилось в Национальном Институте Рака МОЗ Украины, г. Киев, ул. Ломоносова 33/43.
Предоперационное лазерное облучение тимуса или области его проекции выполнялось согласно двух протоколов: однократное воздействие на область проекции тимуса и непосредственное лазерное облучение тимуса при помощи световода, подведенного через катетер к месту его локализации.

Лазерное облучение области проекции тимуса проведено 10 больным немелкоклеточным раком легкого без неоадъювантного лечения однократно. Средний возраст больных (57,3+2,7) лет.
Лазерное облучение тимуса проведено 10 больным с онкоторакальной патологией (у 7 больных немелкоклеточный рак легкого, у 2 тератобластома средостения, у 1 - злокачественный плеврит). Средний возраст больных (39,9+3,9) лет.
Иммунологические исследования проводились до лазерного воздействия, на 1-, 4- и 7-е сутки после лазерного облучения тимуса или области его проекции. Статистическая обработка данных проводилась при помощи программы STATISTICA 6.0 (8Ш8ой. 1пс., США) с использованием одновыборочного критерия Уилкоксона.

В отделении опухолей головы и шеи Национального института рака проводилась клиническая апробация воздействия лазерного медико-биологического комплекса на опухоль полости рта. Локальное лазерное облучение опухоли выполнено 8 пациентам с гистологически верифицированным диагнозом плоскоклеточный рак слизистой оболочки полости рта в возрасте от 39 до 71 года. Рак слизистой оболочки языка диагностирован у 2, дна полости рта - у 5, твердого неба - у 1. Лазерное воздействие проводилось до начала основного лечения: однократно у 6 больных, двукратно (с интервалом 3 суток) - у 2 больных. У всех больных проводилось морфологическое исследование биопсийного материала до лазерного воздействия и на 6-14-е сутки после лазерного облучения опухоли. В эти же сроки изучалась динамика гематологических и иммунологических показателей.

В отделении опухолей органов грудной полости Национального института рака проводилась клиническая апробация комплекса при облучении как опухоли (плоскоклеточный рак верхней и средней трети пищевода) через вводимый в просвет пищеварительной трубки зонд, так и тимуса (чрезкожная методика и чрезкатетерная). Возраст больных сотставлял от 24 до 73 лет. Плоскоклеточный рак верхней трети пищевода диагностирован у 7, а средней трети - у 11 больных. Железистый рак проксимальных отделов и тела желудка с переходом на пищевод диагностирован у 10, а рак легкого у 15 больных. Единичные больные были с раком гортани, средостения, мезотелиомой плевры, молочной железы, надпочечника. У всех больных проводилось морфологическое исследование биопсийного материала до лазерного воздействия и через неделю после лазерного облучения опухоли (в группе больных с внутриполостным облучением пищевода). До лечения, в середине и по окончании лазерной терапии изучалась динамика гематологических и иммунологических показателей.
Результаты
1. Терапевтическая эффективность лазеротерапии:
1.1. Уменьшение астенического синдрома, когнитивных нарушений с повышением трудоспособности, продуктивной деятельности высших отделов центральной нервной системы, концентрации, внимания, памяти на 20-50% относительно предыдущего состояния у 70-80% больных.
1.2. Уменьшение интенсивности ликвородинамических нарушений, особенно у больных на арахноэнцефалит, уменьшение выражености цефалгий, координаторных нарушений, улучшением стато-локомоторной деятельности, восстановление сферы двигательных и сенсорных поражений, в частности, функциональной деятельности пораженных органов в зоне периферической иннервации, уменьшение интенсивности парезов концовок, восстановление деятельности черепных нервов у 75%;
1.3. Восстановление кинетики желудочно-кишечного тракта при поражении органов пищеварения у 85% больных, особенно у больных с дискинезиями кишечного тракта по гипотоническому типу, диспептическими нарушениями;
1.4. Снижение интенсивности цитолитического и холестатического синдрома при поражении печени наблюдался в 70% больных
1.5. Иммунокоррегирующий эффект наблюдается у 90% больных
- динамическими изменениями относительного и абсолютного количества лимфоцитов и Т-лимфоцитов периферической крови.
- повышением количества CD4+ лимфоцитов (в больных на СПИД у 50% ),
- нормализация показателей иммунорегуляторного индекса.
2. Лазеротерапия по предложенной методике существенно не влияла на уровень вирусемии. Однако, в 20% случаев наблюдалась тенденция к уменьшению уровня вирусемии.
3. Методика лазерной технологии является безопасной для больного.
4. У каждого пятого больного на гепатит С имело место транзиторное повышение активности трансфераз.
5. Противоопухолевые эффекты действия лазерной иммуномодуляции
5.1. Облучение области проекции тимуса мышей линии C57BL проводили лазерным светом в спектральном диапазоне 350-450 нм, плотность мощности на поверхности кожи составляла от 10 до 40 мВт/см2. Время облучения - 10 минут. Лазерное облучение области проекции тимуса приводило к возможному повышению уровня цитотоксичности лимфоцитов и антителозависимой цитотоксической активности лимфоцитов и макрофагов мышей. Наибольшее повышение активности отмечено через сутки после облучения, когда индекс цитотоксичности в исследовательской группе был больше, чем в контрольной в 3 раза. Такая высокая цитотоксическая активность лимфоцитов сохранялась на протяжении 3-х суток. Установлено, что модулирующее действие лазерного облучения носило дозозависимый характер. Использование малых доз (меньше 10 мВт/см2) лазерного облучения достоверно не повышало цитотоксичность эффекторов.
5.2. Отдельными опытами установлено, что лазерное облучение разных интенсивностей области проекции тимуса не приводило к лейко-, эритро- и тромбопении, не сопровождалось явлениями воспаления в месте контакта с кожей и не вызвало летальных случаев у животных.
5.3. На модели экспериментального злокачественного опухолевого роста - саркомы 45 изучали противоопухолевое действие лазерного облучения. Исследование (всего три серии опытов) проводили на нелинейных белых щурах. Облучение проводили единовременно, через 4 сутки после трансплантации опухоли. Как свидетельствуют данные, лазерное облучение проекции тимуса обуславливало выраженный противоопухолевый эффект. Так, наилучшие данные были получены в первом опыте, когда торможение роста саркомы отмечалось в 97,19-63,93 % случаев на разные сроки измерения. Процент первичного излечения в этой группе составляет 40,0 %.
5.4. Однократное лазерное облучение области проекции тимуса (через кожу, неинвазивный способ) у больных раком легкого приводит к повышению уровня ТСФ (истинный гормон тимуса) в периферической крови, нормализации соотношения основных субпопуляций Т-лимфоцитов, повышению относительного количества ЕК-клеток, снижению относительного количества активированных (С04+СБ25+) Т-хелперов (в том числе регуляторных Т-клеток), модуляции количества активированных Т-клеток (СОЗ НЬА-ОЯ , СБЗ+СБ95+).
5.5. Непосредственное лазерное облучение тимуса (через имплантируемое оптоволокно, инвазивный способ) у больных с онкоторакальной патологией обладает более выраженным иммунокорригирующем действием, чем такое при неинвазивном способе, что может быть обусловлено прямым воздействием ткань этого органа.
5.6. Анализ результатов изучения гистологических препаратов опухолевой ткани полости рта (биопсийный материал) позволил установить определенные проявления лечебного патоморфоза, вызванного внешним фактором (лазерное воздействие). Эффект разной степени выраженности по морфологическим критериям (некротические и дегенеративные процессы в паренхиме опухоли, угнетение митотической активности опухолевых клеток, инфильтрация опухоли иммунокомпетентными клетками, сосудистая реакция) был зарегистрирован при оценке биопсийного материала у 5 (62,5 %) из 8 пациентов. Эти данные свидетельствуют о том, что лазерное излучение (с известными параметрами) может девитализировать опухолевые клетки без нанесения ущерба нормальным тканям и способствует развитию воспалительной реакции в строме опухоли.
5.7. Клинически у всех больных раком пищевода буквально после первых сеансов лазерного облучения отмечено уменьшение болевого синдрома, улучшение настроения, сна, улучшение прохождения грубой пищи по пищеводу (рентгенологически отмечено увеличения просвета пищевода от 2-3 мм до 5-8 мм в диаметре). У больных легче проходит подготовка к операции, а также быстрее проходит реабилитация в послеоперационный период.
5.8. Исследовались также две группы пациентов: проходящие химиотерапию и проходящие лучевую терапию. Всем больным перед процедурами проводились сеансы лазерной терапии в область тимуса. Предварительные результаты показывают, что больные легче переносят как химио, так и лучевую терапию. Проводимый контроль показателей крови во время и после завершения сеансов показывает, что количество лейкоцитов при проведении лазеротерапии не опускается ниже 2000 (обычно 1000 и ниже).

Таким образом, предложенный метод продемонстрировал значительные терапевтические эффекты, связанные с противовоспалительным, иммуномоделирующим, регенераторным, противоопухолевым действием лазеротерапии. Кроме того, получен выраженный противоопухолевый эффект.
К вышеупомянутым факторам следует прибавить широкий спектр показаний к лазерной терапии и возможность ее применения рядом с традиционными средствами лечения, а также как новый способ лечения больных раком верхней и средней трети пищевода после прохождения ими стандартных методов лечения.. К преимуществам метода следует также отнести неинвазивность большинства лазерных процедур, их безболезненность и комфортность для пациентов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Спектры поглощения пигментов растений и фраунгоферовы линии Солнца / Кондратьев К.Я., Каневский В.А.и др. //Доклады Академии наук СССР, 1986, т.287, N 2, с.507-509.
2. Фотовозбуждение електронной оболочки атома Магния и функционирование Na-K Атфазы /Кондратьев К.Я., Рожманова О.М., Каневский В.А., Федченко П.П.//Доклады Академии наук СССР, 1987, т.292, N 5, с.1264 - 1266.
3. Фраунгоферовы линии Солнца и устойчивость геометрической структуры биологических молекул /Кондратьев К.Я. , Каневский В.А. и др. // Экспресс-информация Академии наук СССР, N 3-87, Ленинград, 16 с.
4. Действие синего света на электронный транспорт в дыхательной цепы митохондрий /Кондратьев К.Я. , Каневский В.А., Кузьменко И.В. и др.// Доклады Академии наук СССР, 1988, т. 299, N 5, с.1271-1274.